Parámetros Inmunitarios de Pollos de Engorde Suplementados con Adsorbentes y Cuantificación Desafiados con Micotoxinas

Ciencias Veterinarias y Animales 2022; 10(4): 78-82 http://www.sciencepublishinggroup.com/j/avs doi: 10.11648/j.avs.20221004.11 ISSN: 2328-5842 (Imprimir); ISSN: 2328-5850 (en línea)

1. Introducción A nivel mundial, los alimentos y los piensos se han contaminado gravemente con micotoxinas, de las cuales las más comunes son la aflatoxina, la zearalenona, la fumonisina, el deoxinivalenol y la ocratoxina [23].

En los animales de granja, el consumo de micotoxinas, a niveles que no causan micotoxicosis clínica, suprime las funciones inmunitarias y puede disminuir la resistencia a las enfermedades infecciosas [1]. Existen varios parámetros relevantes para evaluar el estado inmunitario de los animales, incluidos los ensayos de fagocitosis e interleucina. Según Sattler et al. [24], la fagocitosis se ha convertido en un proceso central de la primera línea de defensa del sistema inmunológico contra los patógenos. Los fagocitos profesionales captan los microbios, los matan y los digieren, y activan la respuesta inmunitaria subsiguiente. Esencialmente, las citoquinas representan una red integrada de mediadores celulares capaces de desencadenar diversos efectos biológicos influenciados por el estado predominante del organismo [2]. Las citoquinas aviares, similares a las de los mamíferos, influyen en la respuesta inmune del huésped a la infección patógena. Generalmente clasificadas como proinflamatorias o antiinflamatorias, las citocinas son secretadas por diversas poblaciones celulares después de la estimulación [21]. En particular, tanto los tipos proinflamatorios como los antiinflamatorios provocan distintas respuestas a los inmunógenos en diferentes etapas de una infección [3]. IL-6 se considera un indicador temprano y sensible de reacciones inflamatorias. Es el estimulante básico de la síntesis de proteínas de fase aguda en el hígado. En condiciones inflamatorias, la concentración de IL-6 en el suero de los pacientes aumenta muchas veces [5]. La interleucina IL10 es una de las principales citocinas antiinflamatorias. Al suprimir distintas funciones de las células asesinas naturales y principalmente de los linfocitos T, previene la producción de IL-12 y otras citocinas proinflamatorias (como TNFα, IL-6 e IL-1β) por parte de las APC [20, 27]. La IL-10 previene el aumento de la expresión de varios genes en las células fagocíticas y dendríticas que normalmente son inducidas por la estimulación de los TLR (toll like receptor) [27]. El uso de detoxificadores de micotoxinas como aditivos para alimentos tiene como objetivo reducir la toxicidad de las micotoxinas en los ingredientes de alimentos contaminados, lo que permite su uso en la formulación de alimentos para animales [16]. Existe una amplia gama de desintoxicantes de micotoxinas, con una miríada de afirmaciones equivalentes [12]. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de diferentes adsorbentes de micotoxinas, con diferentes composiciones, sobre los parámetros inmunológicos de pollos de engorde desafiados con las micotoxinas aflatoxina, fumonisina y DON. Con cinco tratamientos y seis repeticiones, totalizando 30 unidades experimentales, siendo cada jaula una unidad experimental compuesta por diez aves.

Las dietas experimentales se formularon para cumplir con los requisitos nutricionales, de acuerdo con las recomendaciones de la NRC [22]. Las dietas fueron isocalóricas, isoproteicas e isovitamínicas, según la composición mostrada en la tabla 1. Las materias primas y dietas experimentales fueron analizadas para la presencia de micotoxinas (aflatoxinas, deoxinivalenol, diacetoxiscirpenol, umonisina, ocratoxina A, toxina T-2 y zearalenona) , y no se detectaron micotoxinas en las materias primas utilizadas.   1 nivel de garantía por kg de producto: Ácido fólico: 140 mg/kg; Ácido Pantot 1700 mg/kg; biotina: 15 mg/kg; Calcio: 30/130 g/kg; cobre: 1410 mg/kg; colina: 40 g/kg DL-metionina: 260 g/kg; Enramicina: 1333 mg/kg; Hierro: 8500 mg/kg Yodo: 150 mg/kg; Lisina: 50 g/kg; Manganeso: 12 g/kg; Niacina: 5930 mg/kg; Selenio: 45 mg/kg; vitamina A: 1800000 UI/kg, Vit. B1: 580 mg/kg; vitamina B12: 3000 microgramos/kg; vitamina B2: 960 mg/kg; vitamina B6: 730 mg/kg; vitamina D3: 300000 UI/kg; vitamina E: 3750 UI/kg; vitamina K3: 300 mg/kg, Zinc: 9170 mg/kg.

Tabla 1. Composición de las dietas.

Ingredientes	%
Maíz	63,00
Harina de soja	29,80
Aceite de soja	3,00
lisina	0,10
metionina	0,04
fosfato dicálcico	2,00
piedra caliza calcítica	1,00
sal	0,46
premezcla1	0,60
Composición calculada
proteína cruda	20%
Energía Metabolizable	3050 kcal/kg
Met+ quiste	0,95%
lisina	1,19%
Calcio	0,95%
fósforo disponible	0,48%
Sodio	0,22%

2. Material y Métodos 2.1. animales Este proyecto fue aprobado por la Comisión de Ética en el uso de animales (CEUA) de la empresa SAMITEC – CEUA/SAMITEC.288.274. Se utilizaron 300 pollos de engorde machos de la línea 500 de Cobb, con un día de edad y un peso promedio de 41,88 gramos. La prueba experimental se llevó a cabo en una sala experimental de 22 m2, con presión negativa, aclimatado. Los animales se alojaron en jaulas experimentales, cada una con un ancho de 0,5 m, una longitud de 0,5 my una altura de 0,33 m, dispuestas en cuatro niveles superpuestos, cada nivel con dos jaulas. Cada jaula contaba con un bebedero tipo comedero, bebedero tipo tetina con regulación de altura. 2.2. Diseño Experimental y Dietas Las aves se distribuyeron en un diseño completamente al azar. Las aves recibieron alimento y agua ad libitum durante el período experimental (1 – 21 días). Se probaron tres adsorbentes de micotoxinas con diferentes composiciones, que se agregaron 2,5 kg/kg, en dietas contaminadas con micotoxinas, utilizando 1,0 PPM de aflatoxina + 50,0 ppm de fumonisina + 25,0 ppm de DON.

Las aflatoxinas (B1, B2, G1 y G2) se obtuvieron del cultivo de una cepa de toxina de Aspergillus parásito, y las concentraciones utilizadas fueron B1: 93.8%, B2: 2.1%, G1: 3.4% y G2: 0.7%. Las fumonisinas (B1 y B2) se obtuvieron del cultivo de una cepa de toxina de Fusarium moniliforme, y las concentraciones utilizadas fueron 95.8% de B1 y 4.2% de B2. Y la micotoxina deoxinivalenol (DON) se obtuvo del cultivo de una cepa de toxina de Fusarium graminearum. Se evaluó dieta control sin contaminación, dieta contaminada con micotoxinas sin absorbente, dieta contaminada + SIM – FIX HP®, dieta contaminada + adsorbente A, dieta contaminada + adsorbente B. El adsorbente SIM – FIX HP® se presenta en su composición: 1.3 y 1.6 beta-glucanos, bentonita policénica, carbón activado, molécula orgánica, silimarina y selenio orgánico. Y, según informan los fabricantes, en los respectivos envases, el adsorbente A contiene la siguiente composición: levadura de cerveza seca (glucomananos), silicato de Na y Ca, y harina de ostra. Mientras que el adsorbente B está compuesto por: bentonita, diatomita, Eubacterium sp, harina de algas, levadura inactivada, pulpa de achicoria seca.

2.3. Expresión génica de interleucina IL 6 e IL 10 Al final del período experimental, se recolectaron amígdalas cecales y se determinó la expresión de interleucinas proinflamatorias (IL 6) y antiinflamatorias (IL 10) mediante la cuantificación de la expresión génica por RT-qPCR. La cuantificación de la expresión génica se realiza mediante RT-qPCR, utilizando cebadores (primers) específicos para cada diana. En este tipo de análisis, cada combinación de objetivo y muestra genera un valor umbral, Ct (ciclo umbral), una medida de la concentración de ARN mensajero (ARNm) específico del objetivo en la muestra. El valor de Ct debe normalizarse en función de los genes de referencia elegidos previamente, generando un valor deltaCt (dCt) (gen de referencia Ct objetivo-Ct). Para la extracción de ARN, se homogeneizaron aproximadamente 100 mg de tejido en TissueLyser (Qiagen), y el ARN total se purificó mediante extracción con TRI® Reagent (Sigma) – cloroformo. Los extractos se trataron con turboDNaseI (Ambion) y el ARN se cuantificó con NanoDrop (Thermo Scientific). Los ADNc se sintetizaron usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alto rendimiento (Applied Biosystems), usando 1 ug de ARN por reacción. Los ADNc se diluyeron 5 veces en agua MilliQ estéril y los objetivos se cuantificaron utilizando Bright-Green PCR Master Mix (Biotium) en un termociclador QuantStudio 3 (Thermo). El ciclado utilizado fue de 95°C 10min, seguido de 40 ciclos de 95°C 15s y 60°C 1min. Se utilizó el programa Primer Express 3.0 para diseñar los cebadores de oligonucleótidos. Los genes GAPDH y ACTB se utilizaron como controles internos y la expresión génica relativa se determinó mediante el método 2-∆∆Ct [17]. 2.4. Análisis estadístico Los datos se sometieron a análisis de varianza y comparación de medias mediante la prueba de Tukey en 5%.   3. Resultados y Discusión Los resultados de la expresión génica de las interleucinas IL-6 e IL-10 se muestran en la Figura 1. Se observó una menor expresión de IL-6 en las aves que recibieron una dieta contaminada con micotoxina + adsorbente B, que sirven para contener la producción. de promoléculas -inflamatorias para limitar el daño tisular y para mantener o restaurar la homeostasis tisular.

El efecto de las micotoxinas en el sistema inmunitario de las aves se puede resumir de la siguiente manera: disminución de la actividad de los linfocitos T o B (bursa y timo regresivos), supresión de la producción de inmunoglobulinas y anticuerpos, reducción de la actividad del complemento o del interferón, deterioro de la función de las células efectoras de macrófagos y reducción de los títulos de anticuerpos y la concentración sérica de antibióticos [11]. Básicamente, las citocinas median el resultado de una respuesta inmunitaria eficaz y sirven como interfaz entre los dos brazos (es decir, elementos innatos y adaptativos) de un sistema inmunitario complejo [9]. IL-6 también tiene un efecto pirogénico. Junto con IL-1, TNF e INF, esta citocina puede aumentar significativamente la temperatura corporal al estimular la producción de prostaglandinas. El aumento de la producción de IL-6 y el mantenimiento de una concentración sérica elevada de esta citocina favorecen la transición de una reacción inflamatoria aguda a la fase crónica [5]. La mayor expresión de IL-10, considerando el escenario de contaminación y adición de adsorbentes, se observó en el grupo desafiado y suplementado con el adsorbente YES – FIX HP. Este hecho probablemente esté relacionado con su composición y resulte de la sinergia entre sus principios activos. Además de las materias primas responsables de la adsorción de las principales micotoxinas que se encuentran en el campo, este adsorbente contiene principios conocidos por tener acción inmunomoduladora, antioxidante y antiinflamatoria 1,3 y 1,6 beta-glucanos de la levadura Sacharomyces cerevisiae, selenio orgánico y extracto de cardo mariano (silimarina) a diferencia de los otros adsorbentes analizados, la IL-10 es una citocina inmunorreguladora cuya función principal es limitar las respuestas inflamatorias [6], con potentes propiedades antiinflamatorias que desempeñan un papel central en la limitación del sistema inmunitario del huésped. respuesta a los patógenos, previniendo así el daño al huésped y manteniendo la homeostasis tisular normal [13]. Según De Smedt et al. [7], la IL-10 juega un papel fundamental en el control de la respuesta inmune, equilibrando la respuesta entre Th1 y Th2 al regular la síntesis de citocinas por parte de las células que presentan antígenos y reducirlos, a diferencia de otros tratamientos. Lo cual, al estar desequilibrado, podría indicar inmunosupresión del sistema de defensa de las aves. Los demás tratamientos no difirieron estadísticamente entre sí.

La respuesta inmunitaria a los patógenos implica la activación rápida de citoquinas proinflamatorias que sirven para iniciar la defensa del huésped contra la invasión microbiana. Sin embargo, el exceso de inflamación puede dar lugar a trastornos metabólicos y hemodinámicos sistémicos perjudiciales para el huésped. Como resultado, el sistema inmunitario ha evolucionado en paralelo con los mecanismos de daño tisular antiinflamatorios. La función del beta-glucano presente en Yes-Fix HP es principalmente la adsorción de micotoxinas, especialmente zearalenona [30]. Además, los β-glucanos son conocidos como moduladores del sistema inmunológico, actuando principalmente sobre los macrófagos, ejerciendo un efecto beneficioso contra una variedad de bacterias, virus, hongos y parásitos [19], que pueden reducir la liberación de citocinas proinflamatorias [28]. ].

Como los b-glucanos no están presentes en las células animales, el sistema inmunitario los considera "extraños" y actúan como un patrón molecular asociado a microbios (MAMP), que activa principalmente a los miembros de la inmunidad innata [26]. Sin embargo, llama la atención que los atributos inmunomoduladores de estas moléculas, que inducen respuestas reguladoras de mayor o menor intensidad, probablemente estén relacionados con su grado de purificación y las biotecnologías involucradas en su proceso de producción.

Según Zabriskie et al. [31], el mecanismo de inmunorregulación mediado por el beta-glucano depende de su interacción con las células inmunitarias ubicadas en el intestino, las cuales reconocen estos oligosacáridos. Una respuesta inflamatoria excesiva se asocia con estrés oxidativo [15]; el selenio regula la activación de NF-κB, un factor de transcripción, que juega un papel clave en la regulación de las vías inflamatorias [14]. El selenio puede inhibir que NF-κB active genes relacionados con la inflamación que eventualmente reducen la expresión de citocinas proinflamatorias [8]. La función antiinflamatoria del Se puede deberse a la presencia de selenoproteínas específicas, como la glutatión peroxidasa (GPx), que reduce los cambios inflamatorios inducidos por la oxidación en el hígado [18].

Además del β-glucano y el selenio orgánico, otra particularidad de la composición de Yes – Fix HP es la presencia de silimarina. La silimarina es un producto natural, extraído de las semillas y frutos de la planta Silybum marianum (cardo mariano), y su eficacia se ha atribuido a mecanismos antioxidantes, antiinflamatorios e inmunomoduladores que actúan sobre diversas vías de señalización celular [25, 4] . Wang et al. [29] observaron una reducción en la expresión de interleucinas proinflamatorias con la administración de silimarina antes del desafío con hepatotoxicidad aguda inducida por triploides. Según Esmaeila et al. [10], la silimarina inhibe la activación del factor kappaB al suprimir la degradación inhibidora de kappa B (IκB) y suprime la respuesta inflamatoria, el estrés oxidativo. Además, la silimarina, al suprimir las vías de señalización STAT3 y ERK1/2, inhibe la oncogénesis, la proliferación celular, la migración celular y la expresión del gen iNOS.

[Expresión génica relativa de IL-6 EL NUEVO. p<0,0001 1.5 | 1.0 | 0.5 | 0.0 Adsorbente Fix HP Control Control con micotoxinas Adsorbente A Adsorbente B ]

[ Expresión génica relativa de IL-10 ANOVA, P<0,0001 1.5 | 1.0 |0.5 | 0.0 Control Control con micotoxinas Adsorbent Fix HP tAbsorbente A Absorbente B ]

Figura 1. Expresión génica de interleucinas IL-6 e IL-10 en amígdalas cecales de pollos de engorde desafiados con micotoxinas y diferentes adsorbentes.

4. Conclusión Suplementación con adsorbente SIM – FIX HP® permitió una mayor expresión de IL-10, posiblemente relacionada con su composición y resultado de la sinergia entre sus principios activos. Además de las materias primas responsables de la adsorción de las principales micotoxinas que se encuentran en el campo, este adsorbente contiene conocidos principios de acción inmunomoduladora, antioxidante y antiinflamatoria, que pueden contribuir a fortalecer la salud de los animales. Referencias 1. Aly, E., Madbouly, Y. (2016). El efecto de las micotoxinas en la respuesta inmune de los pollos de engorde a las vacunas vivas contra la EN aplicadas por diferentes vías. Medio Este Diario de Aplicado ciencias, 06 (01), 51-58. 2. Arseniy EY, Anton GK (2014). interleucinas en Cáncer Biología: Su heterogéneo Desplazarse. Elsevier; Londres, Reino Unido: Prensa académica; Cambridge, MA, Estados Unidos. 3. Bello RO, Chin VK, Abd Rachman Isnadi MF et al. (2018). El papel, la participación y la(s) función(es) de la interleucina-35 y la interleucina-37 en la patogénesis de la enfermedad. Internacional Diario de Molecular Ciencias. 19 (4). 4. Bijak, M. (2017). Silibina, un componente bioactivo principal del cardo mariano (Silybum marianum L. Gaernt.)—Química, biodisponibilidad y metabolismo. moléculas, 22, 1 a 11. Borzecki, P.

5. Borzecka A., Chylinska-Wrzos P., Lis-Sochocka M., Wawryk-Gawda E., Jodlowska-Jedrych. (2019). Evaluación de la concentración de interleucina-6 en el hígado de ratones Albino Swiss después de la intoxicación con varias dosis de patulina. actual Cuestiones Farmacia Medicina. ciencia., 32 (1), 34-39. 6. Cho, MJ, Ellebrecht, CT, Payne, AS (2015). La naturaleza dual de la interleucina-10 en el pénfigo vulgar. citocina, 73 (2), 335-341. 7. De Smedt, T., van Mechelen, M., De Becker, G., Urbain, J., Leo, O. y Moser, M. (1997). Efecto de la interleucina-10 sobre la maduración y función de las células dendríticas. europeo Diario de Inmunología. 27, 1229-1235. 8. Duntas, LH (2012). El papel evolutivo del selenio en el tratamiento de la enfermedad de Graves y la oftalmopatía. j tiroides resolución, 736161. 9. Duke AG y Descoteaux A. (2014). Citocinas de macrófagos: participación en la inmunidad y enfermedades infecciosas. Frente. inmunol, 5, 491. 10. Esmaeila N., Anarakib BS, Gharagozlooc M., Moayedia B. (2017). Impactos de la silimarina en el sistema inmunológico como inmunomodulador: una llave para muchas cerraduras. Internacional inmunofarmacología, 50, 194-201.

11. Hofstetter, U. (2007). Los efectos negativos de varias micotoxinas en el sistema inmunológico de las aves de corral. Boletín BIOMIN, 5-46. 12. Holanda, DM, Kim, SW (2020). Eficacia de los detoxificadores de micotoxinas en la salud y el crecimiento de cerdos recién destetados sometidos a un desafío dietético crónico con deoxinivalenol. toxinas, 12, 311. 13. Iyer, SS, Cheng, G. (2012). Papel de la regulación transcripcional de la interleucina 10 en la inflamación y las enfermedades autoinmunes. Crit Rev Inmunol. 32(1), 23-63. Khan, AZ 14. Khan, IU, Khan, S. …Ran L. (2019). Los probióticos enriquecidos con selenio mejoran la protección hepática al regular las citocinas proinflamatorias y la capacidad antioxidante en pollos de engorde en condiciones de estrés por calor Revista de investigación veterinaria y animal avanzada. 6 (3), 355-361. 15. Kim, SH, Oh, DS, Oh, J.Y, Son, TG, Yuk, D.Y, Jung, S. (2016). La silimarina previene la lesión hepática aguda inducida por el estrés de restricción al mejorar el estrés oxidativo y reducir la respuesta inflamatoria. moléculas 21,443. 16. Lauwers M, Croubels S, Letor B, Gougoulias C, Devreese M (2019). Biomarcadores de exposición como herramienta para la prueba de eficacia de un desintoxicante de micotoxinas en pollos y cerdos de engorde. toxinas, 11, 187. 17. Livak, KJ, Schmittgen, TD (2001). Análisis de datos de expresión génica relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real y 2 (-Delta C(T)) Método. Métodos, 25 (4), 402-8. 18. Liu Y, Liu Q, Ye G, Khan A, Liu J, Gan F, et al. (2015). Efectos protectores de los probióticos enriquecidos con selenio sobre la fibrosis hepática inducida por tetracloruro de carbono en ratas. J Química alimentaria agrícola; 63, 242. 19. Mantovani MS, Bellini MF, Angeli JP, Oliveira RJ, Silva AF, Ribeiro LR (2008). Beta-glucanos en la promoción de la salud: prevención contra la mutación y el cáncer. MutatRes., 658 (3), 154-61. 20. Moore, KW, Waal Malefyt, R.de, Coffman, RL y O'Garra, A. (2001). Interleucina-10 y el receptor de interleucina-10. Revisión anual de inmunología, 19, 683-765.

21. Ning X., Jian Z., Wang W. (2015). Niveles séricos bajos de interleucina 35 en pacientes con artritis reumatoide. Exp. Tohoku J. Medicina, 237, 77-82. 22. Consejo Nacional de Investigaciones L. Requerimientos de nutrientes de las aves de corral. 9ª ed. Washington, DC: Academia Nacional de Ciencias, 1994. 154 p. 23. Qu D., Huang X., Han J., Man N. (2017). Eficacia del adsorbente mixto para mejorar la ocratoxicosis en pollos de engorde alimentados con dietas contaminadas con ocratoxina A. italiano J Anim Sci. 16, 573-579. 24. Sattler N., Monroy R., Soldati T. (2013) Análisis cuantitativo de fagocitosis y maduración de fagosomas. En: Eichinger L., Rivero F. (eds) Protocolos de Dictyostelium discoideum. Métodos en Biología Molecular (Métodos y Protocolos), vol 983. Humana Press, Totowa, NJ. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-302-2_21 25. Shahbazi, F., Dashti-Khavidaki, S., Khalili, H., Lessan-Pezeshki, M., (2012). Posibles efectos renoprotectores de la silimarina contra fármacos nefrotóxicos: una revisión de la literatura. Revista de Farmacia y Ciencias Farmacéuticas, 15, 112-123. 26. Soltanian, S., Stuyven, E., Cox, E., Sorgeloos, P. y Bossier, P. (2009) Beta-glucanos como inmunoestimulantes en vertebrados e invertebrados. crítico Rdo. Microbiol., 35, 109-138. 27. Trinchieri, G. (2007). Producción de interleucina-10 por células T efectoras: las células Th1 muestran autocontrol. El diario de medicina experimental., 204 (2), 239-43. 28. Tzianabos, AO (2000). Inmunomoduladores de polisacáridos como agentes terapéuticos: aspectos estructurales y función biológica. Clínica. Microbiol., 13, 523-533. 29. Wang L, Huang QH, Li YX, et al. Efectos protectores de la silimarina sobre la hepatotoxicidad aguda inducida por triptolida en ratas. Mol Med Rep. 2018; 17(1): 789-800. doi: 10.3892/mmr.2017.7958. 30. Yiannikouris A., Francois J., Poughon L., Dussap CG, Bertin G., Jeminet G., Jouany JP (2004). Adsorción de zearalenona por beta-D-glucanos en la pared celular de Saccharomyces cerevisiae. J. FoodProt. 67, 1195-1200. 31. Zabriskie, Hannah A., Julia C. Blumkaitis, Jessica M. Moon, Brad S. Currier, Riley Stefan, Kayla Ratliff y Chad M. Kerksick (2020). La suplementación con beta-glucano de levadura regula a la baja los marcadores de inflamación sistémica después del ejercicio en cinta rodante calentada. nutrientes, 12 (4), 1144.