Parâmetros Imunológicos de Frangos de Corte Suplementados com Adsorventes e Quantificação Desafiados com Micotoxinas

Ciências Veterinárias e Animais 2022; 10(4): 78-82 http://www.sciencepublishinggroup.com/j/avs doi: 10.11648/j.avs.20221004.11 ISSN: 2328-5842 (Impressão); ISSN: 2328-5850 (Online)

1. Introdução Globalmente, alimentos e rações têm sido seriamente contaminados com micotoxinas que aflatoxina, zearalenona, fumonisina, desoxinivalenol e ocratoxina são as mais encontradas [23].

Em animais de granja o consumo de micotoxinas, em níveis que não causam micotoxicose clínica, suprimem as funções imunológicas e podem diminuir a resistência a doenças infecciosas [1]. Há vários parâmetros relevantes para avaliar o estado imunológico dos animais, incluindo ensaios de fagocitose e das interleucinas. De acordo com Sattler et al. [24], a fagocitose se tornou um processo central da primeira linha de defesa do sistema imunológico contra patógenos. Os fagócitos profissionais absorvem micróbios, matam e digerem-nos, e ativam a resposta imunológica subsequente. Essencialmente, as citocinas representam uma rede integrada de mediadores celulares capazes de desencadear diversos efeitos biológicos influenciados pelo estado prevalecente do organismo [2]. As citocinas aviárias, semelhantes às dos mamíferos, são influentes na resposta imunológica do hospedeiro à infecção patogênica. Normalmente classificadas como pró-inflamatórias ou anti-inflamatórias, as citocinas são secretadas por diversas populações celulares após estimulação [21]. Notavelmente, tanto os tipos pró-inflamatórios quanto os anti-inflamatórios provocam respostas distintas aos imunogênicos em diferentes estágios de uma infecção [3]. A IL-6 é considerada um indicador precoce e sensível de reações inflamatórias. É o estimulante básico da síntese proteica de fase aguda no fígado. Em condições inflamatórias, a concentração de IL-6 no soro dos pacientes aumenta muitas vezes [5]. A Interleucina IL10 é uma das principais citocinas anti-inflamatórias. Suprimindo funções distintas das células assassinas naturais e linfócitos T principalmente, ela impede a produção de IL-12 e outras citocinas pró-inflamatórias (como TNFα, IL-6 e IL-1β) por APCs [20, 27]. A IL-10 impede o aumento da expressão de vários genes em células fagocitárias e dendríticas que são normalmente induzidas pela estimulação de TLRs (receptor toll like) [27]. O uso de desintoxicantes de micotoxinas como aditivos alimentares tem como objetivo reduzir a toxicidade das micotoxinas em ingredientes de ração contaminados, permitindo seu uso na formulação de rações para animais [16]. Existe uma ampla gama de desintoxicantes de micotoxinas, com uma miríade equivalente de reivindicações [12]. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes adsorventes de micotoxinas, com diferentes composições, sobre os parâmetros imunológicos de frangos de corte desafiados com as micotoxinas aflatoxina, fumonisina e DON. Com cinco tratamentos e seis réplicas, totalizando 30 unidades experimentais, sendo cada gaiola uma unidade experimental composta de dez aves.

As dietas experimentais foram formuladas para atender às exigências nutricionais, de acordo com as recomendações do NRC [22]. As dietas foram isocalóricas, isoproteicas e isovitamínicas, de acordo com a composição mostrada na tabela 1. As matérias-primas e dietas experimentais foram analisadas quanto à presença de micotoxinas (aflatoxinas, desoxinivalenol, diacetoxiscirpenol, umonisina, ocratoxina A, toxina T-2 e zearalenona), e nenhuma micotoxina foi detectada nas matérias-primas utilizadas.   1 nível de garantia por kg de produto: Ácido Fólico: 140 mg/kg; Ácido Pantot 1700 mg/kg; biotina: 15 mg/kg; Cálcio: 30/130 g/kg; cobre: 1410 mg/kg; colina: 40 g/kg de DL-metionina: 260 g/kg; Enramicina: 1333 mg/kg; Ferro: 8500 mg/kg Iodo: 150 mg/kg; Lisina: 50 g/kg; Manganês: 12 g/kg; Niacina: 5930 mg/kg; Selênio: 45 mg/kg; vit. A: 1800000 UI/kg, Vit. B1: 580 mg/kg; vit. B12: 3000 mcg/kg; vit. B2: 960 mg/kg; vit. B6: 730 mg/kg; vit. D3: 300000 UI/kg; vit. E: 3750 UI/kg; vit. K3: 300 mg/kg, Zinco: 9170 mg/kg.

Tabela 1. Composição das dietas.

Ingredientes	%
Milho	63,00
Farelo de soja	29,80
Óleo de soja	3,00
Lisina	0,10
Metionina	0,04
Fosfato dicálcico	2,00
Calcário calcítico	1,00
Sal	0,46
Premix1	0,60
Composição calculada
Proteína bruta	20%
Energia Metabolizável	3050 Kcal/Kg
Met+ Cist	0,95%
Lisina	1,19%
Cálcio	0,95%
Fósforo disponível	0,48%
Sódio	0,22%

2.  Material e Métodos 2.1.   Animais Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no uso de animais (CEUA) da empresa SAMITEC – CEUA/SAMITEC.288.274. Foram utilizados 300 frangos de corte machos da linha 500 da Cobb, com um dia de idade e peso médio de 41,88 gramas. O teste experimental foi realizado em sala experimental, 22 m2, com pressão negativa, aclimatada. Os animais foram alojados em gaiolas experimentais, cada uma com uma largura de 0,5m, um comprimento de 0,5m e uma altura de 0,33m, dispostos em quatro níveis sobrepostos, cada nível com duas gaiolas. Cada gaiola tinha um bebedouro do tipo comedouro, bebedouro do tipo mamilo com ajuste de altura. 2.2.   Design Experimental e Dietas As aves foram distribuídas em um design completamente aleatório. As aves receberam ração e água ad libitum durante o período experimental (1 – 21 dias). Foram testados três adsorventes de micotoxinas com diferentes composições, que foram adicionados 2,5kg/kg, em dietas contaminadas com micotoxinas, utilizando 1,0 PPM de aflatoxina + 50,0 ppm de fumonisina + 25,0 ppm de DON.

As aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2) foram obtidas do cultivo de uma cepa toxínica de Aspergillus parasiticus, e as concentrações utilizadas foram B1: 93,8%, B2: 2,1%, G1: 3,4% e G2: 0,7%. A fumonisina (B1 e B2) foi obtida do cultivo de uma cepa toxínica de Fusarium moniliforme, e as concentrações utilizadas foram 95,8% de B1 e 4,2% de B2. E a micotoxina deoxinivalenol (DON) foi obtida a partir do cultivo de uma cepa toxínica de Fusarium graminearum. Avaliamos uma dieta de controle sem contaminação, dieta contaminada com micotoxinas sem absorvente, dieta contaminada + SIM – FIX HP®, dieta contaminada + adsorvente A, dieta contaminada + adsorvente B. O adsorvente SIM – FIX HP® se apresenta em sua composição: 1,3 e 1,6 beta-glucanos, bentonita policênica, carvão ativado, molécula orgânica, silimarina e selênio orgânico. E, conforme informado pelos fabricantes, na respectiva embalagem, adsorvente A contém a seguinte composição: fermento cervejeiro seco (glucomannans), silicato de Na e Ca, e farinha de ostras. Enquanto adsorvente B é composto de: bentonita, diatomita, Eubacterium sp, farinha de algas marinhas, levedura inativada, polpa de chicória seca.

2.3. Expressão Gênica da Interleucinas IL 6 e IL 10 No final do período experimental, as tonsilas cecais foram coletadas e determinaram a expressão das interleucinas pró-inflamatórias (IL 6) e anti-inflamatórias (IL 10) quantificando a expressão gênica por RT-qPCR. A quantificação da expressão gênica é realizada por RT-qPCR, usando iniciadores específicos (primers) para cada alvo. Neste tipo de análise, cada combinação de alvo e amostra gera um valor limiar, Ct (threshold cycle), uma medida da concentração do RNA mensageiro específico do alvo (mRNA) na amostra. O valor Ct precisa ser normalizado em função de genes de referência previamente escolhidos gerando um valor deltaCt (dCt) (Ct target-Ct reference gene). Para extração de RNA, aproximadamente 100mg de tecido foram homogeneizados em TissueLyser (Qiagen), e o RNA total foi purificado por extração com Reagente TRI® (Sigma) – clorofórmio. Os extratos foram tratados com turboDNaseI (Ambion) e o RNA foi quantificado com NanoDrop (Thermo Scientific). cDNAs foram sintetizados usando o kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade (Applied Biosystems), usando 1 ug de RNA por reação. cDNAs foram diluídos 5x em água MilliQ estéril, e alvos quantificados usando Bright-Green PCR Master Mix (Biotium) em um termociclador QuantStudio 3 (Thermo). A ciclagem utilizada foi de 95°C 10min, seguida por 40 ciclos de 95°C 15s e 60°C 1min. O programa Primer Express 3.0 foi usado para projetar os primers de oligonucleotídeos. Os genes GAPDH e ACTB foram usados como controles internos, e a expressão relativa do gene foi determinada usando o método 2-∆∆Ct [17]. 2.4. Análise Estatística Os dados foram submetidos à análise de variância e comparação de meios pelo teste de Tukey a 5%.   3. Resultados e Discussão Os resultados da expressão gênica das interleucinas IL-6 e IL-10 são mostrados na Figura 1. Foi observada menor expressão de IL-6 em aves que receberam a dieta contaminada com micotoxina + adsorvente B, que servem para conter a produção de moléculas pró-inflamatórias para limitar os danos dos tecidos e para manter ou restaurar a homeostase dos tecidos.

O efeito das micotoxinas no sistema imunológico das aves pode ser resumido no seguinte: atividade linfocitária T- ou B- deprimida (bursa regressiva e timo), produção suprimida de imunoglobulina e anticorpos, atividade reduzida de complemento ou interferon, função celular macrofágico-efeitora prejudicada, e redução dos títulos de anticorpos e concentração sérica de antibióticos [11]. Basicamente, as citocinas mediam o resultado de uma resposta imunológica eficaz e servem como interface entre os dois braços (ou seja, elementos inatos e adaptativos) de um sistema imunológico de outra forma complexo [9]. A IL-6 também tem um efeito pirogênico. Juntamente com a IL-1, TNF e INF, esta citocina pode aumentar significativamente a temperatura corporal ao estimular a produção de prostaglandinas. O aumento da produção de IL-6 e a manutenção da alta concentração sérica desta citocina promovem a passagem de uma reação inflamatória aguda para a fase crônica [5]. A maior expressão da IL-10, considerando o cenário de contaminação e adição de adsorventes, foi observada no grupo desafiado e complementada com o adsorvente YES – FIX HP. Este fato está provavelmente relacionado à sua composição e resultou da sinergia entre seus ingredientes ativos. Além das matérias-primas responsáveis pela adsorção das principais micotoxinas encontradas no campo, este adsorvente contém princípios conhecidos por ter ação imunomoduladora, antioxidante e anti-inflamatória 1,3 e 1,6 beta-glucanos da levedura Sacharomyces cerevisiae, selênio orgânico e extrato de cardo de leite (silimarina) diferentes dos outros adsorventes analisados IL-10 é uma citocina imunorreguladora cuja função primária é limitar as respostas inflamatórias [6], com potentes propriedades anti-inflamatórias que desempenham um papel central na limitação da resposta imunológica do hospedeiro a patógenos, evitando assim danos ao hospedeiro e mantendo a homeostase tecidual normal [13]. De acordo com De Smedt et al. [7], a IL-10 desempenha um papel essencial no controle da resposta imune, equilibrando a resposta entre Th1 e Th2 através da regulação da síntese de citocinas por células que apresentam antígenos e reduzindo os diferindo dos outros tratamentos. O que, quando desequilibrado, poderia indicar imunossupressão do sistema de defesa das aves. Os outros tratamentos não diferiram estatisticamente um do outro.

A resposta imunológica aos patógenos envolve a ativação rápida de citocinas pró-inflamatórias que servem para iniciar a defesa do hospedeiro contra a invasão microbiana. Entretanto, o excesso de inflamação pode dar origem a distúrbios metabólicos sistêmicos e hemodinâmicos prejudiciais ao hospedeiro. Como resultado, o sistema imunológico evoluiu paralelamente com os mecanismos anti-inflamatórios danos aos tecidos. A função do beta-glucano presente no Yes-Fix HP é principalmente a adsorção de micotoxinas, especialmente zearalenona [30]. Além disso, β-glucanos são conhecidos como moduladores do sistema imunológico, atuando principalmente sobre macrófagos, exercendo um efeito benéfico contra uma variedade de bactérias, vírus, fungos e parasitas [19], o que pode reduzir a liberação de citocinas pró-inflamatórias [28].

Como os b-glucanos não estão presentes nas células animais, eles são vistos como “estranhos” pelo sistema imunológico e agem como um padrão molecular associado ao micróbio (MAMP), que ativa principalmente os membros da imunidade inata [26]. Entretanto, é notável que os atributos imunomoduladores dessas moléculas, que induzem respostas regulatórias de maior ou menor intensidade, estão provavelmente relacionados a seu grau de purificação e as biotecnologias envolvidas em seu processo de produção.

De acordo com Zabriskie et al. [31], o mecanismo de imunorregulação mediado por beta-glucano depende de sua interação com células imunes localizadas no intestino, que reconhecem esses oligossacarídeos. Uma resposta inflamatória excessiva está associada ao estresse oxidativo [15]; o selênio regula a ativação da NF-κB, um fator de transcrição, que desempenha um papel fundamental na regulação das vias inflamatórias [14]. O selênio pode inibir a NF-κB de ligar os genes relacionados à inflamação que eventualmente reduzem a expressão de citocinas pró-inflamatórias [8]. A função anti-inflamatória da Se pode ser devida à presença de selenoproteínas específicas, como a glutationa peroxidase (GPx) que reduz as alterações inflamatórias induzidas pela oxidação no fígado [18].

Além de β-glucano e selênio orgânico, outra particularidade da composição do Yes – Fix HP é a presença de silimarina. A silimarina é um produto natural, extraído das sementes e frutos da planta Silybum marianum (cardo de leite), e sua eficácia tem sido atribuída aos mecanismos antioxidantes, anti-inflamatórios e imunomoduladores que atuam em várias vias de sinalização celular [25, 4]. Wang et al. [29], observaram uma redução na expressão de interleucinas pró-inflamatórias com a administração de silimarina antes do desafio com hepatotoxicidade aguda induzida por triploides. De acordo com Esmaeila et al. [10], a silimarina inibe a ativação do fator-kappaB através da supressão da degradação inibitória kappa B (IκB) e suprime a resposta inflamatória, o estresse oxidativo. Além disso, a silimarina pela supressão das vias de sinalização STAT3 e ERK1/2, inibe a oncogênese, a proliferação celular, a migração celular e a expressão do gene iNOS.

[ Expressão genética relativa IL-6 ANOVA. P<0,0001 1.5 | 1.0 | 0.5 | 0.0 Adsorvente Fixar HP Controle Controle com micotoxina Adsorvente A Adsorvente B ]

[ Expressão genética relativa IL-10 ANOVA, P<0,0001 1.5 | 1.0 |0.5 | 0.0 Controle Controle com micotoxina Adsorvente Fixar HP tAdsorvente A Absorvente B ]

Figura 1. Expressão gênica das interleucinas IL-6 e IL-10 em tonsilas cecais de frangos de corte desafiados com micotoxinas e diferentes adsorventes.

4. Conclusão A suplementação com o adsorvente SIM – FIX HP® permitiu uma maior expressão do IL-10, que possivelmente está relacionado à sua composição e resultou da sinergia entre seus princípios ativos. Além das matérias-primas responsáveis pela adsorção das principais micotoxinas encontradas no campo, este adsorvente contém princípios conhecidos de ação imunomoduladora, antioxidante e anti-inflamatória, que podem contribuir para o fortalecimento da saúde dos animais. Referências 1. Aly, E., Madbouly, Y. (2016). The Effect of Mycotoxins on Immune Response of Broilers to the Live ND Vaccines Applied by Different Routes. Middle East Journal of Applied Sciences, 06 (01), 51-58. 2. Arseniy E. Y., Anton G. K. (2014). Interleukins in Cancer Biology: Their Heterogeneous Role. Elsevier; London, UK: Academic Press; Cambridge, MA, USA. 3. Bello R. O., Chin V. K., Abd Rachman Isnadi MF et al. (2018). The Role, Involvement and Function(s) of Interleukin-35 and Interleukin-37 in Disease Pathogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4). 4. Bijak, M. (2017). Silybin, a Major Bioactive Component of Milk Thistle (Silybum marianum L. Gaernt.)—Chemistry, Bioavailability, and Metabolism. Molecules, 22, 1-11.Borzecki, P.

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