Parametri immunitari di polli da carne integrati con adsorbenti e quantificazione sfidati con micotossine

Scienze veterinarie e animali 2022; 10(4): 78-82 http://www.sciencepublishinggroup.com/j/avs doi: 10.11648/j.avs.20221004.11 ISSN: 2328-5842 (Stampa); ISSN: 2328-5850 (in linea)

1. introduzione A livello globale, alimenti e mangimi sono stati seriamente contaminati da micotossine, tra cui aflatossina, zearalenone, fumonisina, deossinivalenolo e ocratossina sono le più comuni [23].

Negli animali da allevamento il consumo di micotossine, a livelli che non causano micotossicosi clinica, sopprime le funzioni immunitarie e può diminuire la resistenza alle malattie infettive [1]. Esistono diversi parametri rilevanti per valutare lo stato immunitario degli animali, tra cui la fagocitosi e le analisi dell'interleuchina. Secondo Sattler et al. [24], la fagocitosi è diventata un processo centrale della prima linea di difesa del sistema immunitario contro i patogeni. I fagociti professionali assorbono i microbi, li uccidono e li digeriscono e attivano la successiva risposta immunitaria. In sostanza, le citochine rappresentano una rete integrata di mediatori cellulari in grado di innescare diversi effetti biologici influenzati dallo stato prevalente dell'organismo [2]. Le citochine aviarie, simili a quelle dei mammiferi, sono influenti nella risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogena. Solitamente classificate come pro-infiammatorie o antinfiammatorie, le citochine vengono secrete da diverse popolazioni cellulari dopo la stimolazione [21]. In particolare, sia i tipi pro-infiammatori che quelli anti-infiammatori suscitano risposte distinte agli immunogeni nelle diverse fasi di un'infezione [3]. IL-6 è considerato un indicatore precoce e sensibile delle reazioni infiammatorie. È lo stimolante fondamentale della sintesi proteica della fase acuta nel fegato. In condizioni infiammatorie, la concentrazione di IL-6 nel siero dei pazienti aumenta molte volte [5]. L'interleuchina IL10 è una delle principali citochine antinfiammatorie. Sopprimendo le funzioni distinte delle cellule natural killer e principalmente dei linfociti T, impedisce la produzione di IL-12 e altre citochine pro-infiammatorie (come TNFα, IL-6 e IL-1β) da parte delle APC [20, 27]. IL-10 previene l'aumentata espressione di diversi geni nelle cellule fagocitiche e dendritiche che sono normalmente indotte dalla stimolazione dei TLR (toll like receptor) [27]. L'uso di disintossicanti da micotossine come additivi per mangimi mira a ridurre la tossicità delle micotossine negli ingredienti dei mangimi contaminati, consentendone l'uso nella formulazione di mangimi per animali [16]. Esiste una vasta gamma di disintossicanti da micotossine, con una miriade equivalente di affermazioni [12]. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare l'effetto di diversi adsorbenti di micotossine, con diverse composizioni, sui parametri immunologici dei polli da carne esposti alle micotossine aflatossina, fumonisina e DON. Con cinque trattamenti e sei repliche, per un totale di 30 unità sperimentali, ciascuna gabbia essendo un'unità sperimentale composta da dieci uccelli.

Le diete sperimentali sono state formulate per soddisfare i fabbisogni nutrizionali, secondo le raccomandazioni del NRC [22]. Le diete erano isocaloriche, isoproteiche e isovitaminiche, secondo la composizione riportata in tabella 1. Le materie prime e le diete sperimentali sono state analizzate per la presenza di micotossine (aflatossine, deossinivalenolo, diacetossiscirpenolo, umonisina, ocratossina A, tossina T-2 e zearalenone) , e non sono state rilevate micotossine nelle materie prime utilizzate.   1 livello di garanzia per kg di prodotto: Acido folico: 140 mg/kg; Acido Pantot 1700 mg/kg; biotina: 15 mg/kg; Calcio: 30/130 g/kg; rame: 1410 mg/kg; colina: 40 g/kg DL-metionina: 260 g/kg; Enramicina: 1333 mg/kg; Ferro: 8500 mg/kg Iodio: 150 mg/kg; Lisina: 50 g/kg; Manganese: 12 g/kg; Niacina: 5930 mg/kg; Selenio: 45 mg/kg; vit. A: 1800000 UI/kg, vit. B1: 580mg/kg; vit. B12: 3000mcg/kg; vit. B2: 960mg/kg; vit. B6: 730mg/kg; vit. D3: 300000 UI/kg; vit. E: 3750 UI/kg; vit. K3: 300 mg/kg, Zinco: 9170 mg/kg.

Tabella 1. Composizione delle diete.

ingredienti	%
Mais	63,00
Farina di soia	29,80
Olio di soia	3,00
lisina	0,10
Metionina	0,04
fosfato bicalcico	2,00
calcare calcitico	1,00
sale	0,46
Premiscela1	0,60
Composizione calcolata
proteina cruda	20%
Energia Metabolizzabile	3050Kcal/Kg
Met+ cisti	0,95%
lisina	1,19%
Calcio	0,95%
fosforo disponibile	0,48%
Sodio	0,22%

2. Materiali e Metodi 2.1. Animali Questo progetto è stato approvato dalla Commissione per l'etica nell'uso degli animali (CEUA) della società SAMITEC – CEUA/SAMITEC.288.274. Sono stati utilizzati 300 polli da carne maschi della linea Cobb's 500, con un giorno di età e un peso medio di 41,88 grammi. La prova sperimentale è stata effettuata in una sala sperimentale, 22 m2, con pressione negativa, acclimatato. Gli animali sono stati alloggiati in gabbie sperimentali, ciascuna con una larghezza di 0,5 m, una lunghezza di 0,5 me un'altezza di 0,33 m, disposte in quattro livelli sovrapposti, ogni livello con due gabbie. Ogni gabbia aveva un abbeveratoio tipo mangiatoia, un abbeveratoio tipo capezzolo con regolazione in altezza. 2.2. Disegno sperimentale e diete Gli uccelli sono stati distribuiti in un disegno completamente randomizzato. Gli uccelli hanno ricevuto mangime e acqua ad libitum durante il periodo sperimentale (1 – 21 giorni). Sono stati testati tre adsorbenti di micotossine con diverse composizioni, che sono stati aggiunti 2,5 kg/kg, in diete contaminate da micotossine, utilizzando 1,0 PPM di aflatossina + 50,0 ppm di fumonisina + 25,0 ppm di DON.

Le aflatossine (B1, B2, G1 e G2) sono state ottenute dalla coltivazione di un ceppo tossinico di Aspergillo parassiticoe le concentrazioni utilizzate erano B1: 93.8%, B2: 2.1%, G1: 3.4% e G2: 0.7%. La fumonisina (B1 e B2) è stata ottenuta dalla coltivazione di un ceppo di tossina di Fusarium moniliforme, e le concentrazioni utilizzate erano 95.8% di B1 e 4.2% di B2. E la micotossina deossinivalenolo (DON) è stata ottenuta dalla coltivazione di un ceppo di tossina di Fusarium graminearum. Abbiamo valutato una dieta di controllo senza contaminazioni, dieta contaminata da micotossine senza assorbente, dieta contaminata + SIM – FIX HP®, dieta contaminata + adsorbente A, dieta contaminata + adsorbente B. L'adsorbente SIM – FIX HP® si presenta nella sua composizione: 1,3 e 1,6 beta-glucani, polycene bentonite, carbone attivo, molecola organica, silimarina e selenio organico. E, come informato dai produttori, sulla rispettiva confezione, l'adsorbente A contiene la seguente composizione: lievito di birra secco (glucomannani), silicato di Na e Ca e farina di ostriche. Mentre l'adsorbente B è composto da: bentonite, diatomite, Eubacterium sp, farina di alghe, lievito inattivato, polpa di cicoria essiccata.

2.3. Interleuchina IL 6 e IL 10 Espressione genica Al termine del periodo sperimentale, sono state raccolte le tonsille cecali e l'espressione delle interleuchine pro-infiammatorie (IL 6) e antinfiammatorie (IL 10) è stata determinata quantificando l'espressione genica mediante RT-qPCR. La quantificazione dell'espressione genica viene eseguita mediante RT-qPCR, utilizzando primer specifici (primer) per ciascun bersaglio. In questo tipo di analisi, ogni combinazione di bersaglio e campione genera un valore di soglia, Ct (ciclo di soglia), una misura della concentrazione di RNA messaggero specifico del bersaglio (mRNA) nel campione. Il valore Ct deve essere normalizzato in funzione dei geni di riferimento scelti in precedenza, generando un valore deltaCt (dCt) (gene di riferimento Ct target-Ct). Per l'estrazione dell'RNA, circa 100 mg di tessuto sono stati omogeneizzati in TissueLyser (Qiagen) e l'RNA totale è stato purificato mediante estrazione con TRI® Reagent (Sigma) – cloroformio. Gli estratti sono stati trattati con turboDNaseI (Ambion) e l'RNA è stato quantificato con NanoDrop (Thermo Scientific). I cDNA sono stati sintetizzati utilizzando il kit di trascrizione inversa del cDNA ad alto rendimento (Applied Biosystems), utilizzando 1 ug di RNA per reazione. I cDNA sono stati diluiti 5 volte in acqua MilliQ sterile e gli obiettivi sono stati quantificati utilizzando il Master Mix per PCR verde brillante (Biotium) in un termociclatore QuantStudio 3 (Thermo). Il ciclo utilizzato è stato di 95°C 10min, seguito da 40 cicli di 95°C 15s e 60°C 1min. Il programma Primer Express 3.0 è stato utilizzato per progettare i primer oligonucleotidici. I geni GAPDH e ACTB sono stati utilizzati come controlli interni e l'espressione genica relativa è stata determinata utilizzando il metodo 2-∆∆Ct [17]. 2.4. analisi statistica I dati sono stati sottoposti ad analisi della varianza e confronto delle medie mediante il test di Tukey a 5%.   3. Risultati e discussione I risultati dell'espressione genica delle interleuchine IL-6 e IL-10 sono mostrati in Figura 1. Una minore espressione di IL-6 è stata osservata negli uccelli che hanno ricevuto una dieta contaminata da micotossina + adsorbente B, che servono a contenere la produzione di molecole pro-infiammatorie per limitare il danno tissutale e per mantenere o ripristinare l'omeostasi tissutale.

L'effetto delle micotossine sul sistema immunitario del pollame può essere riassunto come segue: ridotta attività dei linfociti T o B (borsa e timo regressivi), soppressa produzione di immunoglobuline e anticorpi, ridotta attività del complemento o dell'interferone, alterata funzione delle cellule effettrici dei macrofagi e riduzione dei titoli anticorpali e della concentrazione sierica di antibiotici [11]. Fondamentalmente, le citochine mediano l'esito di una risposta immunitaria efficace e fungono da interfaccia tra i due bracci (cioè elementi innati e adattivi) di un sistema immunitario altrimenti complesso [9]. IL-6 ha anche un effetto pirogeno. Insieme a IL-1, TNF e INF, questa citochina può aumentare significativamente la temperatura corporea stimolando la produzione di prostaglandine. L'aumento della produzione di IL-6 e il mantenimento di un'elevata concentrazione sierica di questa citochina favoriscono il passaggio da una reazione infiammatoria acuta alla fase cronica [5]. La massima espressione di IL-10, considerando lo scenario di contaminazione e aggiunta di adsorbenti, è stata osservata nel gruppo sfidato e integrato con l'adsorbente YES – FIX HP. Questo fatto è probabilmente legato alla sua composizione ed è il risultato della sinergia tra i suoi principi attivi. Oltre alle materie prime responsabili dell'adsorbimento delle principali micotossine presenti in campo, questo adsorbente contiene principi noti per avere azione immunomodulante, antiossidante e antinfiammatoria 1,3 e 1,6 beta-glucani del lievito Sacharomyces cerevisiae, selenio organico ed estratto di cardo mariano (silimarina) a differenza degli altri adsorbenti analizzati IL-10 è una citochina immunoregolatrice la cui funzione primaria è quella di limitare le risposte infiammatorie [6], con potenti proprietà antinfiammatorie che svolgono un ruolo centrale nel limitare le difese immunitarie dell'ospite risposta ai patogeni, prevenendo così danni all'ospite e mantenendo la normale omeostasi tissutale [13]. Secondo De Smedt et al. [7], IL-10 svolge un ruolo essenziale nel controllo della risposta immunitaria, bilanciando la risposta tra Th1 e Th2 regolando la sintesi di citochine da parte delle cellule che presentano antigeni e riducendole, a differenza di altri trattamenti. Che, se sbilanciato, potrebbe indicare un'immunosoppressione del sistema di difesa degli uccelli. Gli altri trattamenti non differivano statisticamente l'uno dall'altro.

La risposta immunitaria ai patogeni comporta una rapida attivazione di citochine pro-infiammatorie che servono ad avviare la difesa dell'ospite contro l'invasione microbica. Tuttavia, l'eccessiva infiammazione può dare origine a disturbi metabolici ed emodinamici sistemici dannosi per l'ospite. Di conseguenza, il sistema immunitario si è evoluto parallelamente ai meccanismi di danno tissutale antinfiammatorio. La funzione del beta-glucano presente in Yes-Fix HP è principalmente l'adsorbimento di micotossine, in particolare lo zearalenone [30]. Inoltre, i β-glucani sono noti come modulatori del sistema immunitario, agendo principalmente sui macrofagi, esercitando un effetto benefico contro una varietà di batteri, virus, funghi e parassiti [19], che possono ridurre il rilascio di citochine pro-infiammatorie [28 ].

Poiché i b-glucani non sono presenti nelle cellule animali, sono visti come "estranei" dal sistema immunitario e agiscono come un modello molecolare associato ai microbi (MAMP), che attiva principalmente i membri dell'immunità innata [26]. Tuttavia, è da notare che gli attributi immunomodulatori di queste molecole, che inducono risposte regolatorie di maggiore o minore intensità, sono probabilmente correlati al loro grado di purificazione e alle biotecnologie coinvolte nel loro processo produttivo.

Secondo Zabriskie et al. [31], il meccanismo di immunoregolazione mediato dal beta-glucano dipende dalla sua interazione con le cellule immunitarie situate nell'intestino, che riconoscono questi oligosaccaridi. Una risposta infiammatoria eccessiva è associata allo stress ossidativo [15]; il selenio regola l'attivazione di NF-κB, un fattore di trascrizione, che svolge un ruolo chiave nella regolazione delle vie infiammatorie [14]. Il selenio può inibire l'attivazione di NF-κB di geni correlati all'infiammazione che alla fine riducono l'espressione di citochine pro-infiammatorie [8]. La funzione antinfiammatoria di Se può essere dovuta alla presenza di specifiche selenoproteine, come la glutatione perossidasi (GPx), che riduce i cambiamenti infiammatori indotti dall'ossidazione nel fegato [18].

Oltre al β-glucano e al selenio organico, un'altra particolarità della composizione di Yes – Fix HP è la presenza della silimarina. La silimarina è un prodotto naturale, estratto dai semi e dai frutti della pianta Silybum marianum (cardo mariano), e la sua efficacia è stata attribuita a meccanismi antiossidanti, antinfiammatori e immunomodulatori che agiscono su varie vie di segnalazione cellulare [25, 4] . Wang et al. [29] hanno osservato una riduzione dell'espressione di interleuchine pro-infiammatorie con la somministrazione di silimarina prima della sfida con l'epatotossicità acuta indotta dai triploidi. Secondo Esmaeila et al. [10], la silimarina inibisce l'attivazione del fattore-kappaB sopprimendo la degradazione inibitoria della kappa B (IκB) e sopprimendo la risposta infiammatoria, lo stress ossidativo. Inoltre, la silimarina, sopprimendo le vie di segnalazione STAT3 e ERK1/2, inibisce l'oncogenesi, la proliferazione cellulare, la migrazione cellulare e l'espressione del gene iNOS.

[ Espressione genica relativa di IL-6 IL NUOVO. P<0,0001 1.5 | 1.0 | 0,5 | 0.0 Adsorbent Fix HP Control Controllo con micotossina Adsorbente A Adsorbente B ]

[ Espressione genica relativa di IL-10 ANOVA, P<0,0001 1.5 | 1,0 |0,5 | 0.0 Controllo Controllo con micotossine Adsorbent Fix HP tAssorbente A Assorbente B ]

Figura 1. Espressione genica delle interleuchine IL-6 e IL-10 nelle tonsille cecali di polli da carne trattati con micotossine e diversi adsorbenti.

4. Conclusione Supplementazione con adsorbente SIM – FIX HP® ha permesso una maggiore espressione di IL-10, che è probabilmente correlata alla sua composizione e risulta dalla sinergia tra i suoi principi attivi. Oltre alle materie prime responsabili dell'adsorbimento delle principali micotossine presenti in campo, questo adsorbente contiene noti principi di azione immunomodulante, antiossidante e antinfiammatoria, che possono contribuire a rafforzare la salute degli animali. Riferimenti 1. Aly, E., Madbouly, Y. (2016). L'effetto delle micotossine sulla risposta immunitaria dei polli da carne ai vaccini vivi ND applicati per vie diverse. Mezzo est rivista di Applicato Scienze, 06 (01), 51-58. 2. Arseniy EY, Anton GK (2014). Interleuchine in Cancro Biologia: I loro eterogeneo scorrere. Elsevier; Londra, Regno Unito: Academic Press; Cambridge, MA, USA. 3. Bello RO, Chin VK, Abd Rachman Isnadi MF et al. (2018). Il ruolo, il coinvolgimento e le funzioni dell'interleuchina-35 e dell'interleuchina-37 nella patogenesi della malattia. internazionale rivista di Molecolare Scienze. 19 (4). 4. Bijak, M. (2017). Silibina, un importante componente bioattivo del cardo mariano (Silybum marianum L. Gaernt.)—Chimica, biodisponibilità e metabolismo. molecole, 22, 1-11 Borzecki, P.

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