Immunparametrar för slaktkycklingar kompletterade med adsorbenter och kvantifiering utmanad med mykotoxiner

Veterinär- och husdjursvetenskap 2022; 10(4): 78-82 http://www.sciencepublishinggroup.com/j/avs doi: 10.11648/j.avs.20221004.11 ISSN: 2328-5842 (Print); ISSN: 2328-5850 (online)

1. Introduktion Globalt har livsmedel och foder blivit allvarligt förorenade med mykotoxiner varav aflatoxin, zearalenon, fumonisin, deoxynivalenol och ochratoxin är de vanligaste [23].

Hos husdjur kan konsumtion av mykotoxiner, i nivåer som inte orsakar klinisk mykotoxikos, dämpa immunfunktioner och kan minska motståndskraften mot infektionssjukdomar [1]. Det finns flera relevanta parametrar för att bedöma immunstatus hos djur, inklusive fagocytos- och interleukinanalyser. Enligt Sattler et al. [24] har fagocytos blivit en central process i immunsystemets första försvarslinje mot patogener. Professionella fagocyter tar upp mikrober, dödar och smälter dem och aktiverar det efterföljande immunsvaret. I huvudsak representerar cytokiner ett integrerat nätverk av cellulära mediatorer som kan utlösa olika biologiska effekter påverkade av det rådande tillståndet hos organismen [2]. Fågelcytokiner, liknande däggdjurscytokiner, är inflytelserika i värdens immunsvar på patogen infektion. Vanligtvis klassificeras som pro-inflammatoriska eller anti-inflammatoriska, cytokiner utsöndras av olika cellpopulationer efter stimulering [21]. Noterbart är att både pro-inflammatoriska och antiinflammatoriska typer framkallar distinkta svar på immunogener i olika stadier av en infektion [3]. IL-6 anses vara en tidig och känslig indikator på inflammatoriska reaktioner. Det är den grundläggande stimulansen för proteinsyntesen i akut fas i levern. Vid inflammatoriska tillstånd ökar koncentrationen av IL-6 i serum hos patienter många gånger [5]. Interleukin IL10 är en av de viktigaste antiinflammatoriska cytokinerna. Undertrycker distinkta funktioner hos naturliga mördarceller och främst T-lymfocyter, förhindrar produktionen av IL-12 och andra pro-inflammatoriska cytokiner (såsom TNFα, IL-6 och IL-1β) av APCs [20, 27]. IL-10 förhindrar ökat uttryck av flera gener i fagocytiska och dendritiska celler som normalt induceras av stimulering av TLR (toll like receptor) [27]. Användningen av mykotoxiner som avgiftningsmedel som fodertillsatser syftar till att minska toxiciteten hos mykotoxiner i kontaminerade foderingredienser, vilket möjliggör användning av dem i djurfoderformuleringar [16]. Det finns ett brett utbud av mykotoxin avgiftningsmedel, med en likvärdig myriad av påståenden [12]. Syftet med denna studie var att utvärdera effekten av olika mykotoxinadsorbenter, med olika sammansättning, på de immunologiska parametrarna hos slaktkycklingar som utmanats med mykotoxinerna aflatoxin, fumonisin och DON. Med fem behandlingar och sex replikat, totalt 30 experimentenheter, där varje bur är en experimentell enhet bestående av tio fåglar.

De experimentella dieterna formulerades för att möta näringsbehoven, enligt NRC:s rekommendationer [22]. Dieterna var isokaloriska, isoproteiniska och isovitaminiska, enligt sammansättningen som visas i tabell 1. Råvarorna och experimentdieterna analyserades med avseende på närvaron av mykotoxiner (aflatoxiner, deoxynivalenol, diacetoxiscirpenol, umonisin, ochratoxin A, toxin T-2 och zearalenon) , och inga mykotoxiner upptäcktes i de använda råvarorna.   1 garantinivå per kg produkt: Folsyra: 140 mg/kg; Pantotsyra 1700 mg/kg; biotin: 15 mg/kg; Kalcium: 30/130 g/kg; koppar: 1410 mg/kg; kolin: 40 g/kg DL-metionin: 260 g/kg; Enramycin: 1333 mg/kg; Järn: 8500 mg/kg Jod: 150 mg/kg; Lysin: 50 g/kg; Mangan: 12 g/kg; Niacin: 5930 mg/kg; Selen: 45 mg/kg; vit. A: 1800000 IE/kg, Vit. B1: 580 mg/kg; vit. B12: 3000 mcg/kg; vit. B2: 960 mg/kg; vit. B6: 730 mg/kg; vit. D3: 300 000 IU/kg; vit. E: 3750 IU/kg; vit. K3: 300 mg/kg, zink: 9170 mg/kg.

Bord 1. Sammansättning av dieter.

Ingredienser	%
Majs	63,00
Sojamjöl	29,80
Sojaolja	3,00
lysin	0,10
Metionin	0,04
Dikalciumfosfat	2,00
kalcitisk kalksten	1,00
salt-	0,46
förblandning1	0,60
Sammansättning beräknad
råprotein	20%
Metaboliserbar energi	3050 Kcal/Kg
Met+ Cysta	0,95%
lysin	1,19%
Kalcium	0,95%
fosfor tillgängligt	0,48%
Natrium	0,22%

2. Material och metoder 2.1. Djur Detta projekt godkändes av kommissionen för etik vid användning av djur (CEUA) från företaget SAMITEC – CEUA/SAMITEC.288.274. 300 slaktkycklingar av hankön från Cobbs 500-linje, med en dags ålder och en medelvikt på 41,88 gram, användes. Det experimentella testet utfördes i ett försöksrum, 22 m2, med undertryck, acklimatiserat. Djuren hölls i experimentburar, var och en med en bredd av 0,5 m, en längd av 0,5 m och en höjd av 0,33 m, arrangerade i fyra överlappande nivåer, varje nivå med två burar. Varje bur hade en drickare av matartyp, en dricksbehållare av bröstvårta med höjdjustering. 2.2. Experimentell design och dieter Fåglar delades ut i en helt randomiserad design. Fåglarna fick foder och vatten ad libitum under försöksperioden (1 – 21 dagar). Tre mykotoxinadsorbenter med olika sammansättning testades, vilka tillsattes 2,5 kg/kg, i dieter kontaminerade med mykotoxiner, med användning av 1,0 ppm aflatoxin + 50,0 ppm fumonisin + 25,0 ppm DON.

Aflatoxiner (B1, B2, G1 och G2) erhölls från odling av en toxinstam av Aspergillus parasiticusoch de använda koncentrationerna var B1: 93,8%, B2: 2,1%, G1: 3,4% och G2: 0,7%. Fumonisin (B1 och B2) erhölls från odling av en toxinstam av Fusarium moniliformeoch de använda koncentrationerna var 95,8% av B1 och 4,2% av B2. Och mykotoxinet deoxynivalenol (DON) erhölls från odling av en toxinstam av Fusarium graminearum. Vi utvärderade en kontrolldiet utan kontaminering, mykotoxinförorenad kost utan absorberande, kontaminerad kost + SIM – FIX HP®, förorenad kost + adsorbent A, kontaminerad kost + adsorbent B. SIM-adsorbenten – FIX HP® presenterar sig i sin sammansättning: 1,3 och 1,6 beta-glukaner, polycenbentonit, aktivt kol, organisk molekyl, silymarin och organiskt selen. Och, som tillverkarna har informerat om, på respektive förpackning, innehåller adsorbent A följande sammansättning: torr bryggjäst (glukomannaner), Na- och Ca-silikat och ostronmjöl. Medan adsorbent B består av: bentonit, diatomit, Eubacterium sp, tångmjöl, inaktiverad jäst, torkad cikoriamassa.

2.3. Interleukin IL 6 och IL 10 genuttryck I slutet av experimentperioden samlades cekala tonsiller och uttrycket av pro-inflammatoriska (IL 6) och antiinflammatoriska (IL 10) interleukiner bestämdes genom att kvantifiera genuttryck med RT-qPCR. Kvantifiering av genuttryck utförs med RT-qPCR, med användning av specifika primrar (primers) för varje mål. I denna typ av analys genererar varje kombination av mål och prov ett tröskelvärde, Ct (tröskelcykel), ett mått på koncentrationen av målspecifikt budbärar-RNA (mRNA) i provet. Ct-värdet måste normaliseras som en funktion av tidigare valda referensgener, vilket genererar ett deltaCt (dCt) värde (Ct target-Ct referensgen). För RNA-extraktion homogeniserades cirka 100 mg vävnad i TissueLyser (Qiagen), och det totala RNA:t renades genom extraktion med TRI® Reagent (Sigma) – kloroform. Extrakt behandlades med turboDNaseI (Ambion) och RNA kvantifierades med NanoDrop (Thermo Scientific). cDNA syntetiserades med användning av High Throughput cDNA Reverse Transcription-kit (Applied Biosystems), med användning av 1 ug RNA per reaktion. cDNA späddes 5x i sterilt MilliQ-vatten och mål kvantifierades med Bright-Green PCR Master Mix (Biotium) i en QuantStudio 3 termocykler (Thermo). Den cykling som användes var 95°C 10 min, följt av 40 cykler med 95°C 15 s och 60°C 1 min. Primer Express 3.0-programmet användes för att designa oligonukleotidprimrarna. GAPDH- och ACTB-generna användes som interna kontroller, och det relativa genuttrycket bestämdes med 2-∆∆Ct-metoden [17]. 2.4. Statistisk analys Data utsattes för variansanalys och jämförelse av medelvärden genom Tukeys test vid 5%.   3. resultat och diskussion Resultaten av genuttrycket av interleukinerna IL-6 och IL-10 visas i figur 1. Ett lägre uttryck av IL-6 observerades hos fåglar som fick en diet förorenad med mykotoxin + adsorbent B, som tjänar till att begränsa produktionen av promolekyler -inflammatorisk för att begränsa vävnadsskada och för att upprätthålla eller återställa vävnadshomeostas.

Effekten av mykotoxiner på fjäderfäimmunsystemet kan sammanfattas på följande sätt: försvagad T- eller B-lymfocytaktivitet (regressiv bursa och tymus), undertryckt immunglobulin- och antikroppsproduktion, minskad komplement- eller interferonaktivitet, försämrad makrofag-effektorcellfunktion, och minskning av antikroppstitrar och serumkoncentration av antibiotika [11]. I grund och botten medierar cytokiner resultatet av ett effektivt immunsvar och fungerar som gränssnittet mellan de två armarna (dvs. medfödda och adaptiva element) i ett annars komplext immunsystem [9]. IL-6 har också en pyrogen effekt. Tillsammans med IL-1, TNF och INF kan detta cytokin avsevärt öka kroppstemperaturen genom att stimulera produktionen av prostaglandiner. Ökningen av IL-6-produktionen och upprätthållandet av en hög serumkoncentration av detta cytokin främjar övergången från en akut inflammatorisk reaktion till den kroniska fasen [5]. Det högsta uttrycket av IL-10, med tanke på scenariot med kontaminering och tillsats av adsorbenter, observerades i den utmanade gruppen och kompletterades med adsorbenten YES – FIX HP. Detta faktum är förmodligen relaterat till dess sammansättning och är resultatet av synergin mellan dess aktiva ingredienser. Förutom de råvaror som är ansvariga för adsorptionen av de viktigaste mykotoxinerna som finns i fältet, innehåller denna adsorbent principer som är kända för att ha immunmodulerande, antioxidant och antiinflammatorisk verkan 1,3 och 1,6 beta-glukaner från jästen Sacharomyces cerevisiae, organiskt selen och extrakt av mjölktistel (silymarin) till skillnad från de andra analyserade adsorbenterna är IL-10 ett immunreglerande cytokin vars primära funktion är att begränsa inflammatoriska svar [6], med potenta antiinflammatoriska egenskaper som spelar en central roll för att begränsa värdens immunförsvar. svar på patogener, vilket förhindrar skador på värden och upprätthåller normal vävnadshomeostas [13]. Enligt De Smedt et al. [7], IL-10 spelar en viktig roll för att kontrollera immunsvaret, balansera svaret mellan Th1 och Th2 genom att reglera syntesen av cytokiner av celler som presenterar antigener och reducera dem, som skiljer sig från andra behandlingar. Vilket i obalans kan tyda på immunsuppression av fåglarnas försvarssystem. De andra behandlingarna skilde sig inte statistiskt från varandra.

Immunsvaret mot patogener involverar snabb aktivering av pro-inflammatoriska cytokiner som tjänar till att initiera värdens försvar mot mikrobiell invasion. Överskottsinflammation kan dock ge upphov till systemiska metabola och hemodynamiska störningar som är skadliga för värden. Som ett resultat har immunförsvaret utvecklats parallellt med antiinflammatoriska vävnadsskademekanismer. Funktionen av beta-glukanen som finns i Yes-Fix HP är huvudsakligen adsorptionen av mykotoxiner, särskilt zearalenon [30]. Vidare är β-glukaner kända som modulatorer av immunsystemet, som huvudsakligen verkar på makrofager och utövar en gynnsam effekt mot en mängd olika bakterier, virus, svampar och parasiter [19], vilket kan minska frisättningen av pro-inflammatoriska cytokiner [28] ].

Eftersom b-glukaner inte finns i djurceller ses de som "främmande" av immunsystemet och fungerar som ett mikrobassocierat molekylärt mönster (MAMP), som huvudsakligen aktiverar medlemmar av medfödd immunitet [26]. Det är dock anmärkningsvärt att de immunmodulerande egenskaperna hos dessa molekyler, som inducerar regulatoriska svar av större eller mindre intensitet, förmodligen är relaterade till deras reningsgrad och biotekniken som är involverad i deras produktionsprocess.

Enligt Zabriskie et al. [31], den immunregleringsmekanism som förmedlas av beta-glukan beror på dess interaktion med immunceller i tarmen, som känner igen dessa oligosackarider. En överdriven inflammatorisk respons är associerad med oxidativ stress [15]; selen reglerar aktiveringen av NF-KB, en transkriptionsfaktor, som spelar en nyckelroll i regleringen av inflammatoriska vägar [14]. Selen kan hämma NF-KB från att slå på inflammationsrelaterade gener som så småningom minskar uttrycket av proinflammatoriska cytokiner [8]. Den antiinflammatoriska funktionen av Se kan bero på närvaron av specifika selenoproteiner, såsom glutationperoxidas (GPx), som minskar de inflammatoriska förändringar som induceras av oxidation i levern [18].

Förutom β-glukan och organiskt selen är en annan speciell egenskap hos kompositionen av Yes – Fix HP närvaron av silymarin. Silymarin är en naturlig produkt, extraherad från frön och frukter av växten Silybum marianum (mjölktistel), och dess effektivitet har tillskrivits antioxidant, antiinflammatoriska och immunmodulerande mekanismer som verkar på olika cellsignaleringsvägar [25, 4]. Wang et al. [29] observerade en minskning av uttrycket av pro-inflammatoriska interleukiner med administrering av silymarin före utmaningen med akut levertoxicitet inducerad av triploider. Enligt Esmaeila et al. [10], silymarin hämmar faktor-kappaB-aktivering genom att undertrycka hämmande kappa B (IκB) nedbrytning och undertrycker det inflammatoriska svaret, oxidativ stress. Dessutom hämmar silymarin, genom att undertrycka STAT3 och ERK1/2 signalvägar, onkogenes, cellproliferation, cellmigration och iNOS-genuttryck.

[ IL-6 relativ genuttryck DEN NYA. P<0,0001 1,5 | 1.0 | 0,5 | 0,0 Adsorbent Fix HP Control Control med mykotoxin Adsorbent A Adsorbent B ]

[ IL-10 relativ genuttryck ANOVA, P<0,0001 1,5 | 1,0 |0,5 | 0,0 Kontrollkontroll med mykotoxin Adsorbent Fix HP tAbsorbent A Absorbent B ]

Figur 1. Genuttryck av IL-6- och IL-10-interleukiner i cekala tonsiller hos broilerkycklingar som utmanats med mykotoxiner och olika adsorbenter.

4. Slutsats Komplettering med SIM-adsorbent – FIX HP® tillät ett större uttryck av IL-10, vilket möjligen är relaterat till dess sammansättning och härrörde från synergin mellan dess aktiva beståndsdelar. Förutom de råvaror som är ansvariga för adsorptionen av de viktigaste mykotoxinerna som finns i fältet, innehåller denna adsorbent kända principer för immunmodulerande, antioxidant och antiinflammatorisk verkan, vilket kan bidra till att stärka djurens hälsa. Referenser 1. Aly, E., Madbouly, Y. (2016). Effekten av mykotoxiner på immunsvaret hos slaktkycklingar mot levande ND-vacciner som appliceras på olika vägar. Mitten Öst Tidning av Applicerad Vetenskaper, 06 (01), 51-58. 2. Arseniy EY, Anton GK (2014). interleukiner i Cancer Biologi: Deras heterogen skrolla. Elsevier; London, Storbritannien: Academic Press; Cambridge, MA, USA. 3. Bello RO, Chin VK, Abd Rachman Isnadi MF et al. (2018). Interleukin-35 och Interleukin-37s roll, delaktighet och funktion(er) i sjukdomspatogenes. internationell Tidning av Molekyl Vetenskaper. 19 (4). 4. Bijak, M. (2017). Silybin, en viktig bioaktiv komponent i mjölktistel (Silybum marianum L. Gaernt.) – Kemi, biotillgänglighet och metabolism. molekyler, 22, 1-11. Borzecki, P.

5. Borzecka A., Chylinska-Wrzos P., Lis-Sochocka M., Wawryk-Gawda E., Jodlowska-Jedrych. (2019). Utvärdering av interleukin-6-koncentration i levern hos Albino schweiziska möss efter förgiftning med olika doser av patulin. Curr. frågor Pharm. Med. Sci., 32 (1), 34-39. 6. Cho, MJ, Ellebrecht, CT, Payne, AS (2015). Den dubbla naturen hos interleukin-10 i pemphigus vulgaris. Cytokin, 73 (2), 335-341. 7. De Smedt, T., van Mechelen, M., De Becker, G., Urbain, J., Leo, O. och Moser, M. (1997). Effekt av interleukin-10 på dendritiska cellmognad och funktion. Europeiska Tidning av Immunologi. 27, 1229-1235. 8. Duntas, LH (2012). Selenets utvecklande roll i behandlingen av Graves sjukdom och oftalmopati. J sköldkörteln res, 736161. 9. Duke AG, & Descoteaux A. (2014). Makrofagecytokiner: Engagemang i immunitet och infektionssjukdomar. Främre. immunol, 5, 491. 10. Esmaeila N., Anarakib BS, Gharagozlooc M., Moayedia B. (2017). Silymarin påverkar immunsystemet som en immunmodulator: En nyckel för många lås. internationell Immunfarmakologi, 50, 194-201.

11. Hofstetter, U. (2007). De negativa effekterna av olika mykotoxiner på immunsystemet hos fjäderfä. BIOMIN Nyhetsbrev, 5-46. 12. Holland, DM, Kim, SW (2020). Effekten av Mycotoxin Detoxifiers på hälsa och tillväxt av nyavvanda grisar under kronisk dietutmaning av deoxynivalenol. gifter, 12, 311. 13. Iyer, SS, Cheng, G. (2012). Interleukin 10:s roll för transkriptionsreglering vid inflammation och autoimmuna sjukdomar. Crit Rev Immunol. 32(1), 23-63. Khan, AZ 14. Khan, IU, Khan, S. …Ran L. (2019). Selenberikad probiotika förbättrar leverskyddet genom att reglera pro-inflammatoriska cytokiner och antioxidantkapacitet hos slaktkycklingar under värmestressförhållanden Journal of Advanced Veterinary and Animal Research. 6 (3), 355-361. 15. Kim, SH, Oh, DS, Oh, J.Y, Son, TG, Yuk, D.Y, Jung, S. (2016). Silymarin förhindrar återhållsamhetsstressinducerad akut leverskada genom att lindra oxidativ stress och minska inflammatorisk respons. molekyler 21,443. 16. Lauwers M, Croubels S, Letor B, Gougoulias C, Devreese M (2019). Biomarkörer för exponering som ett verktyg för effekttestning av ett mykotoxinavgiftningsmedel hos slaktkycklingar och grisar. gifter, 11, 187. 17. Livak, KJ, Schmittgen, TD (2001). Analys av relativa genuttrycksdata med hjälp av kvantitativ PCR i realtid och 2 (-Delta C(T)) Metod. Metoder, 25 (4), 402-8. 18. Liu Y, Liu Q, Ye G, Khan A, Liu J, Gan F, et al. (2015). Skyddseffekter av selenberikade probiotika på koltetrakloridinducerad leverfibros hos råttor. J Agricultural Food Chem; 63, 242. 19. Mantovani MS, Bellini MF, Angeli JP, Oliveira RJ, Silva AF, Ribeiro LR (2008). Beta-glukaner för att främja hälsa: förebyggande mot mutation och cancer. MutatRes., 658 (3), 154-61. 20. Moore, KW, Waal Malefyt, R. de, Coffman, RL, & O'Garra, A. (2001). Interleukin-10 och interleukin-10-receptorn. Årlig översyn av immunologi, 19, 683-765.

21. Ning X., Jian Z., Wang W. (2015). Låga serumnivåer av interleukin 35 hos patienter med reumatoid artrit. Tohoku J. Exp. Med, 237, 77-82. 22. Nationella forskningsrådetL. Näringsbehov hos fjäderfä. 9:e uppl. Washington, DC: National Academy of Science, 1994. 154 sid. 23. Qu D., Huang X., Han J., Man N. (2017). Effektiviteten av blandad adsorbent för att lindra ochratoxikos hos broilers som utfodrats med ochratoxin A-förorenad diet. italienska J Anima Sci. 16, 573-579. 24. Sattler N., Monroy R., Soldati T. (2013) Kvantitativ analys av fagocytos och fagosommognad. I: Eichinger L., Rivero F. (red) Dictyostelium discoideum Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 983. Humana Press, Totowa, NJ. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-302-2_21 25. Shahbazi, F., Dashti-Khavidaki, S., Khalili, H., Lessan-Pezeshki, M., (2012). Potentiella renoprotective effekter av silymarin mot nefrotoxiska läkemedel: En genomgång av litteratur. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 15, 112-123. 26. Soltanian, S., Stuyven, E., Cox, E., Sorgeloos, P. och Bossier, P. (2009) Beta-glukaner som immunstimulerande medel hos ryggradsdjur och ryggradslösa djur. Crit. Varv. Microbiol., 35, 109-138. 27. Trinchieri, G. (2007). Interleukin-10-produktion av effektor-T-celler: Th1-celler visar självkontroll. Journal of experimentell medicin, 204 (2), 239-43. 28. Tzianabos, AO (2000). Polysackaridimmunmodulatorer som terapeutiska medel: strukturella aspekter och biologisk funktion. Klinik. Microbiol., 13, 523-533. 29. Wang L, Huang QH, Li YX, et al. Skyddseffekter av silymarin på triptolidinducerad akut levertoxicitet hos råttor. Mol Med Rep. 2018; 17(1): 789-800. doi: 10.3892/mmr.2017.7958. 30. Yiannikouris A., Francois J., Poughon L., Dussap CG, Bertin G., Jeminet G., Jouany JP (2004). Adsorption av zearalenon av beta-D-glukaner i Saccharomyces cerevisiae cellvägg. J. FoodProt. 67, 1195-1200. 31. Zabriskie, Hannah A., Julia C. Blumkaitis, Jessica M. Moon, Brad S. Currier, Riley Stefan, Kayla Ratliff och Chad M. Kerksick (2020). Jäst beta-glukantillskott nedreglerar markörer för systemisk inflammation efter uppvärmd löpbandsträning. Näringsämnen, 12 (4), 1144.